DNA dizileme, bir DNA parçacığının baz dizisinin belirlenmesi amacıyla kullanılan yöntemler arasında altın standart olma özelliğini korumaktadır. Otomatik DNA dizileme cihazları sayesinde DNA dizileme yöntemi, floresan işaretli dideoksi nükleotitler kullanılarak zincir sonlandırma yaklaşımına dayalı Sanger dizileme yaklaşımının kapiller elektroforez teknolojisiyle kombine edilmesiyle çeşitli genetik analiz çalışmalarında rutin olarak uygulanabilmektedir.
DNA dizileme çalışmasında dizilenecek DNA fragmanları primer adı verilen, çoğaltılması istenilen bölgeye özgü başlatıcı DNA parçacıkları yardımıyla PCR reaksiyonunda çoğaltılır. Dizileme cihazında anot ve katot kutuplar arasında uzanan kapiller, polimerle doldurulduktan sonra negatif yüklü saflaştırılmış PCR ürünü DNA örneğini elektrokinetik yöntemle çekerek pozitif yüklü anoda doğru yürütür. Kapillerin anot ucuna yakın bir bölgesinde bulunan lazer lambasından gelen ışıkla uyarılan floresan boyaların geri yansıttığı ışık detektör tarafından kaydedilir. Kaydedilen veriler dizileme cihazının yazılımı ile matematiksel olarak değerlendirilerek bir grafikle görüntülenir. Elektroferogram adı verilen dizileme sonucunun okunabildiği grafik, gözle ya da çeşitli yazılımlarla incelenebilir.
Sentromer DNA Teknolojileri ABI 3500 otomatik DNA dizileme cihazina sahiptir; ek olarak Illumina NovaSeq 6000 Yeni Nesil Dizileme platformunda dizileme hizmeti sunmakta ve geniş çaplı projelerde birlikte güçlü Biyoinformatik altyapısıyla kaliteli hizmet sağlayabilmektedir.
ÜNİVERSAL PRİMERLER TARAFIMIZDAN SAĞLANIR (M13, SP6, T7, T3, BGH VS.)
Dizilemede kendi primerlerinizi göndermek isterseniz lütfen aşağıdakilere dikkat ediniz; Primerlerinizi:
iyi bir primer tasarım programı kullanarak (Primer Premier, PrimerPlex, Beacon Designer, Primer3 vb), 18 - 24 baz uzunluğunda ve Tm >= 55°C olacak şekilde tasarlayınız;
10 pmol/ul olacak şekilde steril su ile çözeltip en az 30 ul gönderiniz;
%25 indirimli olark Sentromer DNA Teknolojileri'ne sentezletebilirsiniz. Lütfen Oligonükleotit Sentezleme sekmesini ziyaret ediniz.
DNA Dizileme (Sanger Sequencing)
DNA dizileme, genetik bozukluklara yol açan DNA baz değişimlerinin belirlenmesi, topluma özgü gen polimorfizmlerinin bulunması, mikrobiyal hastalıklara neden olan mikroorganizmaların saptanması, adli tıp tanımlamalarına yönelik DNA testleri gibi çok çeşitli çalışmalarda kullanılabilir.
STR (Short Tandem Repeat) Analizi
Parentel analiz veya Mikrosatellit analizi olarak da adlandırılan bu yöntem, genomda bulunan tekrar nükleotit (STR bölgeleri) sayılarının bireyden bireye farklılık göstermesine dayanan bir kimliklendirme yöntemidir.
SNP (Short Nucleotide Polymorphism) Analizi
Tek nükleotit polimorfizmini ya da genlerde bulunan tek baz farklılıklarını saptamaya yönelik bir analiz yöntemidir. Baz farklılıkları bulundukları bölgeye göre protein regülasyonundan işlev yitimine çeşitli genetik bozukluklara neden olup hastalık oluşumuna yol açabilir.
NGS (Next Generation Sequencing) Yeni Nesil Dizileme Analizi
Yeni Nesil Dizileme yöntemi ultra yüksek verim, ölçeklenebilirlik ve hız sunan büyük ölçüde paralel bir dizileme teknolojisidir.
Shotgun dizileme, saf kültür kaynaklı organizmaların genomlarını kapsamlı bir şekilde karakterize etmek için kullanılan bir yaklaşımdır. Bu yöntem, organizma DNA’sının rastgele parçalara ayrılmasını ve bu parçaların paralel olarak dizilenmesini içerir. Elde edilen dizilerin bütün genom sekansına dönüştürülmesi işlemi ise genom assembly olarak adlandırılır.
Genom assembly (birleştirme), izole edilmiş saf kültürden elde edilen genomik DNA’nın fiziksel olarak parçalanmasıyla başlar. Bu fragmantasyon, sonikasyon veyaenzimatik kesim veya mekanik parçalama gibi yöntemlerle gerçekleştirilebilir. Parçalanmış DNA, belirli boyut aralıklarında seçilir ve dizileme platformuna uygun kütüphaneler hazırlanır.
Dizileme verilerinin işlenmesi, ham okumaların kalite kontrolü ile başlar. Düşük kaliteli okumalar, adaptör dizileri ve kontaminant diziler filtrelenir. Kalite kontrolü yapılmış okumalar daha sonra birleştirme algoritmaları kullanılarak daha uzun DNA segmentleri (contig’ler) oluşturmak üzere birleştirilir.
Tek organizma assembly’sinde iki temel yaklaşım uygulanır:
Referans Bazlı Assembly: Eğer yakın bir referans genom mevcutsa, okumalar bu referansa karşı hizalanarak assembly yapılır. Bu yaklaşım hesaplama açısından daha verimlidir ve evrimsel olarak yakın türler için uygundur. BWA, Bowtie ve SOAP gibi yazılımlar bu amaçla sıklıkla kullanılır.
De Novo Assembly: Referans genom bulunmadığında veya incelenen organizmanın genomu önemli derecede farklı olduğunda tercih edilir. Bu yaklaşımda okumalar birbirleriyle doğrudan örtüşme bölgelerine göre birleştirilir. SPAdes, Velvet, ABySS ve Canu gibi assembly yazılımları yaygın olarak kullanılmaktadır.
Assembly sürecinin ardından, contig’ler arası bağlantılar kurularak “scaffold” adı verilen daha uzun yapılar oluşturulur. Bu aşamada, eşleşmiş uç okumaları veya optik haritalama gibi ek veriler kullanılabilir.
