GENEL BİLGİ
Oligonükleotitler Adenin, Guanin, Sitozin ve Timin (RNA'da Urasil) moleküllerinden (DNA bazları) oluşan kısa DNA zincirleridir. Moleküler biyologlar bir numunede belirli bir organizmaya ait DNA varlığını saptamak, hedef DNA'da bulunan bir DNA baz değişimini belirlemek (Mutasyon saptama) veya oluşturmak (Mutajenez), hedef DNA zincirindeki baz sıralarını saptamak (DNA dizileme), çeşitli amaçlarla DNA miktarını çoğaltmak (PCR amplifikasyon) gibi birçok çalışmada ve genetik manipülasyonda kısa oligonükleotitleri (kısaca "oligo" ya da "primer" adı da verilir) kullanır. Bu yöntemlerden bazıları tıpta hastalığa neden olabilecek genetik bozuklukların önceden saptanması ve klinik bulguların teyidi için de kullanılır. Yapılacak çalışmaya göre çoğunlukla özel yazılımlarla tasarlanan oligonükleotitler laboratuvarda kimyasal sentez yoluyla üretilir.
Oligonükleotitlerin solüsyon içinde takip edilebilmesi ya da miktarının saptanması gibi değişik amaçlarla uygulanan çalışmalarda oligonükleotitlerin uçlarına ya da bazların aralarına kimyasal yöntemlerle DNA bazları dışında moleküller de iliştirilebilir. Bunlardan bazıları çeşitli dalga boylarında ışıma yaparken bazıları oligoların katı bir yüzeye ya da başka bir moleküle bağlanmasında kullanılır. Bu tip modifiye ya da işaretli oligolarda bazı moleküller sentezleme aşamasında iliştirilebildiği gibi bazı durumlarda sentez sonrası ek kimyasal reaksiyon ile işaretleme sağlanır.
Oligonükleotit sentezinde fosforamidit kimyası en yaygın yöntemdir. Katı faz sentezi de denilen bu yöntemde her oligo katı faz olarak bir CPG (controlled pore glass ya da 500 veya 1000 Angstrom gibi belirli çapta gözenekli silika tanecikleri olarak çevirelim) ile başlar. Sentezin başlangıcında kullanılan CPG miktarı sentez skalasını belirler (örneğin 200 nmol skala sentezi).
Sık karşılaştığımız yanılma durumu, skala ile sentez sonunda elde edilen miktarın eşit sanılmasıdır. Yöntemin kimyası nedeniyle reaksiyon döngülerinin verimi %100 değildir ve verim oligo uzunluğu ile ters orantılıdır. Yani, bir oligonun uzunluğu arttıkça verimi düşer. Ek olarak saflaştırma işleminde de bir miktar ürün kaybı kaçınılmazdır. Genel olarak elde edilen miktar skalanın yarısı oranındadır. Siparişlerinizi gönderirken bu hususu dikkate almanız önemlidir.
Yukarıda açıklandığı gibi, fosforamidit sentez yönteminde her döngünün bağlanma (coupling) verimliliği tam olmadığından oligonükleotit uzunluğu arttıkça az da olsa tam uzunluk dışında parçacıklar kalır. Son ürünü bu parçacıklardan arındırmak için sadece tuzdan arındırmak yerine RPC veya HPLC saflaştırma tavsiye edilir. Yapacağınız çalışma için en uygun saflaştırma yöntemini seçtiğinizden emin olunuz: HPLC (High Performance Liquid Chromatography), RPC (Reverse Phase Cartridge), veya Standart Tuzdan Arındırma (Desalting).
